Piekielska, Katarzyna

Entwicklung und impedimetrische Untersuchung eines RNA-Assays zur Selektion aktiver Hairpinribozyme

Das Hairpinribozym gehört zu einer Gruppe katalytisch aktiver RNA, die die reversible Spaltung der spezifischen Phosphodiesterbindung katalysiert.

Die Selektion komplementärer und aktiver Ribozymsequenzen aus einer Bibliothek erfordert eine Methode, mit der diese von unpassenden Sequenzen unterschieden und abgetrennt werden können.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivität des Hairpinribozyms mittels elektrochemischer Impedanzspektroskopie analysiert werden kann. Dafür wurde markierungsfreies thioliertes RNA-Substrat als SAM auf einer Goldoberfläche chemisorbiert. Durch Inkubation mit dem Hairpinribozym wurde der Ribozym-Substrat-Komplex erstellt, die Spaltungsreaktion durch Zugabe von Magnesiumionen iniitiert und der Verlauf der Spaltungsreaktion mittels Impedanzspektroskopie verfolgt.

Diese Ergebnisse wurden durch Messungen mit inkomplementären und inaktiven Ribozymsequenzen sowie durch bio(elektro)chemische Untersuchungsmethoden bestätigt.

The hairpin ribozyme belongs to a group of catalytically active RNAs that catalyzes the reversible cleavage of a specific phosphordiester bond.

The selection of complementary and active ribozyme sequences from a library requires a method to distinguish and separate these from unsuitable sequences.

Within the scope of this work it could be shown that the activity of the hairpin ribozyme can be analyzed by electrochemical impedance spectroscopy. For this, a label-free thiolated RNA substrate was chemisorbed as a SAM onto a gold surface. By incubation with the hairpin ribozyme the ribozyme-substrate-complex was created. The cleavage reaction was initiated by addition of magnesium ions and the progress of the reaction monitored by electrochemical impedance spectroscopy.

The results were proven by measurements with incomplementary and inactive ribozyme sequences as well as bio(electro)chemical methods of investigation.